La sua origine risale al 1779, anno in cui l'Accademia dei Regi Studi istituendo la cattedra di "Botanica e Materia medica" le assegnò un modesto appezzamento di terreno per insediarvi un piccolo Orto botanico da adibire alla coltivazione delle piante medicinali utili alla didattica e alla salute pubblica.

Questo primo Orto ben presto si rivelò insufficiente alle necessità e nel 1786 si decise di trasferirlo in quella che è la sede attuale, presso il Piano di Sant'Erasmo, all'epoca tristemente famoso in quanto sede dei roghi della Santa Inquisizione. Nel 1789 fu iniziata la costruzione del corpo principale degli edifici dell'Orto, in stile neoclassico. Esso è costituito da un edificio centrale, il Gymnasium, e da due corpi laterali, il Tepidarium e il Calidarium, progettati dall'architetto francese Léon Dufourny, a cui si deve anche l'impianto della porzione più antica dell'Orto, prossima al Gimnasyum, a schema rettangolare, suddiviso in quattro parallelogrammi, in cui le specie si trovano disposte secondo il sistema di classificazione di Linneo, in base a quanto allora disposto dal padre francescano Bernardino da Ucria, insigne botanico dell'epoca. Il nuovo Orto fu inaugurato nel 1795; negli anni immediatamente successivi si arricchì, dell'Acquarium (1798), una grande vasca in cui prosperano numerose specie di piante acquatiche, e della serra Maria Carolina, portata a compimento nel 1823. Il grande Ficus magnolioides, che costituisce il simbolo del moderno Orto, fu importato dalle Isole Norfolk (Australia), nel 1845. L'estensione attuale, di circa 10 ettari, fu raggiunta, in seguito a successivi ampliamenti, solo nel 1892. Nel 1913 gli fu affiancato un Giardino coloniale poi soppresso. Dal 1985 l'Orto è in affidamento al Dipartimento di Scienze Botaniche.